[00020701]基于溶瘤病毒的肿瘤治疗性疫苗探索

一、项目简介 癌症是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。《JAMA Oncology》杂志公布的2016年全球癌症统计数据显示：2016年全球癌症病例1720万，癌症相关死亡病例890万。与2012年全球癌症统计数据（2012年全球新发病例约1410万，其中死亡病例约820万）相比，全球癌症新增病例增加约21.99 %，死亡病例增加约8.54 %。目前针对癌症的传统治疗手段，如手术、化疗和放疗均存在治疗不彻底、毒副作用大、容易产生耐药性、无法有效控制肿瘤复发和转移等诸多问题，因而无法从根本上彻底治愈肿瘤。近年来发展起来的肿瘤靶向治疗虽然取得了较大的进展，也给临床治疗带来了新的希望。但由于靶向药物治疗仅对特定基因突变的肿瘤发挥作用，且易产生耐药，导致长期的治疗效果不理想，同时由于价格非常昂贵而限制了肿瘤靶向药物的临床应用。因此亟待开发多种新型高效的肿瘤治疗手段。近年来以PD-1/PDL-1抑制剂疗法和溶瘤病毒疗法为代表的肿瘤免疫治疗因其具有良好的安全性和显著的肿瘤治疗效果，而已成为当前肿瘤治疗领域最具前景研究方向之一，也是国内外众多制药企业巨头竞相角逐的重要市场。 由于肿瘤细胞进化出逃避宿主免疫监视机制，抗肿瘤免疫治疗的效果仍不理想（PD-1抑制剂治疗肿瘤的总体应答率为10%-90%，对多数肿瘤适应症应答率约为30%左右），其疗效不理想的原因主要受限于肿瘤细胞表面PDL1的表达水平、T细胞浸润水平、MSI-微卫星稳定性等因素的影响，因此仍急需开发其他治疗手段以改善免疫治疗的疗效。 溶瘤病毒作为新型的肿瘤治疗类药物具有可在肿瘤细胞中实现快速增殖复制，并裂解肿瘤细胞，释放肿瘤特异性抗原，释放的肿瘤抗原可激发机体自身的抗肿瘤免疫反应等突出优势，已日益受到科学家的关注。溶瘤病毒因其具有基因可操控性、规模化、肿瘤选择性等生物学特征使得溶瘤病毒具备作为个性化疫苗应当具备的条件：①通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的肿瘤抗原，并且不受抗原亚细胞定位的局限性，而传统的疫苗则需要细胞膜蛋白作为疫苗；②溶瘤病毒瘤内注射病毒可产生局部感染反应，募集大量免疫细胞；③在溶瘤病毒中加载免疫增强因子（GM-CSF和PD-1抗体基因等），可获得高浓度局部免疫因子，增强抗肿瘤免疫反应；④通过对溶瘤病毒进行改造，病毒可选择性在肿瘤中复制，从而特异性溶解肿瘤细胞，直接发挥肿瘤杀伤作用而不伤害正常组织；⑤溶瘤病毒可以大规模生产，并且质量可控性和稳定性良好。目前基于这一原理设计溶瘤病毒T-VEC获得美国FDA批准上市用于治疗恶性晚期黑色素瘤，为基于溶瘤病毒的肿瘤个性化疫苗的临床应用带来了曙光。 2017年《Cell》杂志报道了一组溶瘤病毒T-VEC联合PD-1抑制剂治疗晚期黑色素瘤的I期临床数据，其中62%的患者达到客观缓解，33%的患者达到完全缓解，显著提高了PD-1抗体的治疗效果。其机制主要是溶瘤病毒T-VEC的局部注射可以显著提高肿瘤浸润性CD8+T淋巴细胞的数目。2017年《自然》子刊《Nature Communications》发表了类似的结果：通过局部注射溶瘤病毒到肿瘤中，能将“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，进而使得PD-1/PDL-1抑制剂能够显示出更强的抗肿瘤作用。 本项目设计的溶瘤病毒（rHSV-APD1）是基于人I型单纯疱疹病毒通过将表达人源PD-1单链抗体基因替换两个病毒双拷贝关键基因，同时以hTert启动子调控病毒立即早期基因的表达而获得的重组型溶瘤病毒。该重组型溶瘤病毒在hTert启动子调控下可选择性地在肿瘤细胞中实现感染和快速复制但在正常细胞中复制较差，同时由于病毒基因组加载了表达人源PD-1单链抗体基因，因此病毒在肿瘤细胞中快速复制的同时会表达大量PD-1单链抗体从而可进一步提高溶瘤病毒肿瘤治疗效果。 本研究的亮点： 1、本研究设计的重组人I型单纯疱疹病毒rHSV-APD1是受肿瘤特异性启动子（hTert启动子）调控的溶瘤病毒，且是在野生型I型单纯疱疹病毒KOS毒株基础上敲除了病毒致病基因，确保了病毒在异常增殖的肿瘤细胞内特异性快速复制，而在正常的细胞中则不能复制，大大增强了溶瘤病毒载体的安全性。 2、本研究将PD-1抗体介导的免疫治疗与溶瘤病毒介导的溶瘤效应有效结合起来，制备了一种可高效表达PD-1单链抗体基因的溶瘤型重组人I型单纯疱疹病毒rHSV-APD1：在溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，大量表达PD1单链抗体，抑制T细胞表面PD-1与肿瘤细胞或抗原递呈细胞表面PDL-1的相互作用，进而激活T细胞免疫应答，发挥双重的抗肿瘤效果。相对于单纯的免疫疗法或者病毒疗法增强了其对恶性肿瘤的疗效。 二、前期研究基础 1. 本项目通过采用CRISPR/Cas-9基因编辑技术，以人I型单纯疱疹病毒（HSV-1）为病毒载体将表达人源PD-1单链抗体的基因替换两个病毒双拷贝关键基因，同时以hTert启动子调控病毒立即早期基因的表达而获得了加载人源PD-1单链抗体基因的重组人I型单纯疱疹病毒型溶瘤病毒（rHSV-APD1）。 2. 本课题组通过对病毒感染、培养条件的细致摸索，已建立了溶瘤病毒rHSV-APD1体外生产、病毒滴度测定及病毒纯化等技术平台 3. 本课题组建立了溶瘤病毒rHSV-APD1体内（血象分析、生化分析、神经毒性评估）和体外（在正常组织来源的正常细胞和肿瘤细胞中的复制与杀伤效果评估）安全性评估系统，并初步证实rHSV-APD1具有良好的安全性（在评价的剂量内对小鼠血象和生化指标无显著性影响、对小鼠无明显的神经毒性；体外对正常细胞基本无杀伤，可显著性杀伤肿瘤细胞） 4. 本课题组建立了溶瘤病毒rHSV-APD1体内（在免疫缺陷鼠和免疫健全鼠模型上建立皮下移植瘤模型、原位肿瘤模型及原发性肿瘤模型）和体外（高通量的肿瘤细胞杀伤效果评估系统）溶瘤病毒疗效评估系统，结果显示rHSV-APD1具有显著的肿瘤治疗效果（病毒感染复数为1时，体外对10余种组织来源的数十种肿瘤细胞的杀伤率均大于60%以上；3针1×107 pfu病毒治疗可完全清除免疫健全小鼠皮下移植的鼠肝癌、鼠肾癌、鼠淋巴瘤等，可显著抑制免疫缺陷鼠皮下移植的人源乳腺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、脑癌等肿瘤的生长）。 5. 本课题组建立了溶瘤病毒rHSV-APD1体内和体外肿瘤治疗机制研究平台，结果显示溶瘤病毒rHSV-APD1在体外可以通过直接裂解肿瘤细胞和通过抑制肿瘤细胞周期进程诱导肿瘤细胞凋亡等途径杀伤肿瘤细胞；瘤内注射溶瘤病毒rHSV-APD1时，一方面病毒可以直接裂解肿瘤细胞，释放的肿瘤抗原可以募集大量的免疫细胞浸润进而诱导机体产生肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫反应；另一方面溶瘤病毒rHSV-APD1在肿瘤组织中快速复制时在肿瘤组织局部能产生大量的PD-1单链抗体可以显著的协同促进溶瘤病毒治疗肿瘤的效果。 三、应用技术成果 本研究通过采用CRISPR/Cas-9基因编辑技术，以人I型单纯疱疹病毒（HSV-1）为病毒载体将表达人源PD-1单链抗体的基因替换病毒双拷贝ICP0和ICP34.5基因，同时以hTert启动子调控病毒ICP27基因的表达而获得了加载人源PD-1单链抗体基因的重组人I型单纯疱疹病毒型溶瘤病毒（rHSV-APD1），具有完全的自主知识产权，已于2015年底交付北京万泰生物药业股份有限公司。目前公司已经相继完成了病毒生产用细胞库的检定及保存，溶瘤病毒毒种批的生产、检定及保存等、溶瘤病毒生产中试工艺开发及质量控制研究、临床前动物安全性评价等临床前研究工作，并取得了突破性进展，目前正在整理临床报批资料，计划今年8月份向CFDA递交申报临床批文的资料，预计明年进入临床研究。 四、合作企业 本项目合作企业为北京万泰生物药业股份有限公司，隶属于养生堂有限公司，是从事生物诊断试剂与疫苗研发及生产的高新技术企业，是中国最大的免疫诊断试剂以及国家生物高新技术产业化示范工程基地。与厦门大学开展了超过20年的长期稳定合作，合作研制了重组戊型肝炎疫苗、宫颈癌疫苗等数个国家一类创新药物，获得数百个诊断试剂证书，具有很强的科研转化实力。