[00064973]具有内毒素吸附能力的耶氏酵母和内毒素减毒大肠杆菌

　　1成果简介
　　研发有效的内毒素LPS脱毒方法具有重要意义，本项目一方面通过KDO定量方法检测对LPS分子的吸附能力，从发酵食品中筛选到LPS吸附能力最强酵母菌株CSW。证实LPS与Y。 lipolytica细胞共存一段时间后，会产生LPS含量降低的现象。通过18s r DNA分析，菌株CSW1与1。0 mg/m L来源于E。 coil O111：B4的LPS共存后，可使LPS水平降低约70%，而S。 cerevisiae BY4742仅使 LPS含量近30%。
　　另外一方面，过敲除大肠杆菌E。 coli染色体基因上与LPS合成相关基因，构建了多株能够直接合成新型特殊结构Kdo2-lipid A的突变菌株，具有低内毒素，适合用于大肠杆菌表达宿主生产各种蛋白及氨基酸。
　　2关键技术
　　脂多糖LPS是存在于大多数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，可通过激活宿主细胞内TLR4受体信号转导途径等，促进炎性细胞分泌多种细胞因子，进而引发强烈的免疫反应，造成疾病或者死亡，在食品和药品中是重要的毒力因子，因此研发有效的LPS脱毒方法具有重要意义。本成果获得了食品级的LPS脱毒菌株，具有应用前景。
　　工业发酵中大肠杆菌野生型菌株中内毒素释放，是导致热原污染的重要原因，这增加了分离纯化成本，本成果从源头改造获得低毒性的大肠杆菌平台菌株，避免了发酵工程中热原产生。
　　3知识产权
　　一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法201410713700。5
　　？一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用201510282822。8
　　4项目成熟度；
　　本成果对酵母菌株脱毒进行了系统验证，采用荧光示踪法分析了酵母菌株对 LPS 的吸附特性。通过不同LPS孵育浓度下的观察结果均表明，Y。 lipolytica细胞表面呈现出明显的LPS附着现象，结合LPS定量结果，可以推测解脂耶氏酵母反应体系中LPS含量明显降低（~70%）与其细胞表面的LPS吸附特性有关；最后分析了酵母对LPS脱毒机制，因此本成果具有重要理论基础。
　　通过基因工程改造获得五株E。 coli突变菌株，所合成的LPS缺失了多糖长链，变为结构特殊的Kdo2-lipid A结构，通过用活菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞，发现五株突变菌株的细胞激起TLR4信号通路的活性比野生型W3110均有所下降；细胞毒性大幅降低。
　　5投资期望及应用情况
　　LPS又称内毒素，是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。因此如何脱除LPS具有重要应用前景，将为食品和制药行业热原去除提供新的解决方法。本成果中的食品级酵母菌株，具有重要推广价值，减毒的大肠杆菌菌株也是工业发酵的良好宿主和底盘细胞。