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[00070286]源于肠道菌的高活性肝素酶
联系人： 天津科技大学
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技术详细介绍
与传统肝素相比，低分子肝素具有更强的抗凝活性，但又很大程度地减小了出血的危险性，因此被广泛应用于临床抗凝治疗中。目前，低分子肝素的制备主要是通过化学法，但存在环保风险大、产物活性易受影响等缺点。生物酶解法可以很好的克服这些问题。目前市场所用肝素酶主要源自肝素黄杆菌（Pedobacter heparinus），通过基因工程方法生产，但其产量、酶活及稳定性均不甚理想，因此严重限制了酶法制备在低分子肝素生产中的应用（目前主要是亭扎肝素等品种使用酶解法）。 在国家重点研发计划、863等项目支持下，本研究通过基因工程技术，在人体肠道有益菌——多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）中鉴定并克隆了与肝素黄杆菌肝素酶具有较高同源性的新的肝素酶I基因（Bt-HepI），构建了其重组大肠杆菌生产菌株，确定了酶学性质，证实该肝素酶具有和工业所用肝素黄杆菌肝素酶I（Ph-HepI）相同的催化活性，但可溶性表达特性则显著优于Ph-HepI，比酶活是pH-HepI的2.05倍。在此基础上，我们进一步应用分子动力学模拟技术对构效关系建议分析后，对酶分子进行了理性分子改造，使重组酶的可溶性表达量和热稳定性均显著提升（50℃半衰期进一步提升到野生型Bt-HepI的2.14倍）。进而，优化确定了工程菌表达的最佳条件，5 L发酵罐的酶活产量可达3.94×105 IU/L，显著高于目前已知报道。 目前，该成果已申请发明专利4项，获得授权专利3项：（1）一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法. NO. ZL201910052220.1. 2021年3月5日授权；（2）一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法. NO. ZL201910052337.X.2021年2月19日授权；（3）一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌. NO. ZL201811086711.X. 2021年9月17日授权 本成果的产量、活性及稳定性均高于目前工业用同类产品，且来源安全可靠，将在抗凝药物低分子肝素的制备、分析等领域具有很好的应用前景。低分子肝素相关药物的全球市场在2015年时便已达130亿美元,且继续以年均10%左右的速度在增长。因此，本成果将具有非常好的社会经济价值。
